נגיף הקצף הסיאמי הזואנוטי בבנגלדש משקף דפוסים מגוונים של שידור והדבקה משותפת

מאמר מלא דמויות ונתונים הפניות ציטוטים מדדים רישוי הדפסות והרשאות PDF תקציר וירוסים מוקצפים (SFVs) נמצאים בכל מקום בפרימטים לא אנושיים (NHPs). כמו בכל הרטרו-וירוסים, שעתוק הפוך של SFV מוביל לרקומבינציה ומוטציה. מכיוון שהוכח כי יותר בני אדם נדבקו ב- SFV מאשר בנגיפים אחרים הנגרמים על ידי סימנים, SFV הוא מודל בעל פוטנציאל רב ללימוד וירולוגיה ואפידמיולוגיה של וירוסים בממשק האדם/NHP. באסיה, SFV מועבר כנראה לבני אדם באמצעות עקיצות מקקים ושריטות המתרחשות בהקשר של חיי היומיום. ניתחנו רצפים פרובירליים מרובים מגן ה- SFV של בנים מבני אדם וממקקים על מנת לאפיין העברה רטרו -ויראלית בממשק האדם/NHP בבנגלדש. כאן אנו מדווחים על עדויות לכך שבני אדם יכולים להידבק במקביל בזני SFV מרובים, כאשר חלק מהאנשים נדבקים הן מזן SFV אוטוטוני כמו גם מזן דומה ל- SFV המצוי במקקים מאזור גיאוגרפי אחר. נתונים אלה, בשילוב עם תוצאות קודמות, מצביעים על כך ששני התנועה המופנית על ידי אנשים של מקקים המובילים להכנסת זנים לא-תושבים של SFV ורקומבינציה רטרו-ויראלית במככים תורמים למגוון SFV בקרב בני אדם בבנגלדש. העברת מבוא וירוסי קצף (FV) הם תת-משפחה של רטרו-וירוסים המופצים באופן נרחב במארחי חוליות, כולל פרימטים לא אנושיים, חתולים, פרות וסוסים .1 Meiering CD, Linial ML. Clin Microbiol Rev2001;14:165–176. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] FVs הם וירוסים אקסוגניים עתיקים המועברים ביעילות בין מארחים אך אינם ידועים כגורמים למחלות.2Switzer WM, Salemi M, Shanmugam Vet al. Ancient co-speciation of simian וירוסים מוקצפים ופרימטים. Nature2005; 434: 376–380. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] למרות שהוא כמעט נמצא בכל מקום בפרימטים לא-אנושיים (NHPs), וירוס הקצף הסימי (SFV) אינו אנדמי ב- Homo sapiens. זיהום זואנוטי בבני אדם עם SFV זוהה בעבר במספר מדינות ובהקשרים שונים של קשר בין מינים, כולל עובדי מעבדות וגן חיות בצפון אמריקה, עובדי 'מקדשי קופים', בעלי חיות מחמד ואנשים החיים סביב מקקים חופשיים בדרום ובדרום מזרח ציידי אסיה ובושמה במרכז אפריקה .3 גססין A, Rua R, Betsem E, Turpin J, Mahieux R. HTLV-3/4 ורטרו-וירוסים מוקצפים בבני אדם: גילוי, אפידמיולוגיה, העברת מיני מינים וירולוגיה מולקולרית. וירולוגיה 2013; 435: 187–199. ] , וירוס דמויי רטרווירוס D או וירוס לימפוטרופי של תאי T.100Gessain A, Rua R, Betsem E, Turpin J, Mahieux R.HTLV-3/3 ורטרו-וירוסים מוקצפים של Simian בבני אדם: גילוי, אפידמיולוגיה, שידור בין מינים וירולוגיה מולקולרית . וירולוגיה 2013; 435: 187–199. [Crossref], [Google Scholar],4Khabbaz RF, Heneine W, George JRet al. Infection of a worker laboratory with simian immunodeficiency virus. N Engl J Med1994; 330: 172–177. [Crossref], [Google Scholar], 5 Lerche NW, Switzer WM, Yee JLet al. J Virol2001; 75: 1783–1789. [Crossref], [Google Scholar], 6 Switzer WM, Bhullar V, Shanmugam Vet al. זיהום נגיף קצף נפוץ אצל אנשים שנחשפו בעיסוק לפרימטים לא אנושיים. J Virol2004; 78: 2780–2789. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar], 7 Kalish ML, Wolfe ND, Ndongmo CBet al. ציידים מרכז אפריקאים שנחשפו לנגיף חיסוני סימי. Emerg Infect Dis2005; 11: 1928–1930. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] בהתחשב בשכיחות הגבוהה של SFV ב- NHP והגיוון והיקף הממשק בין בני אדם ל- NHP, ההערכה היא שמספר האנשים הנגועים בעולם עשוי להגיע לעשרות 8 אנג'ל G, הונגרפורד LL, ג'ונס-אנגל תן ל. הערכת סיכונים: מודל לחיזוי העברה בין מינים של וירוס מוקצף ממאקים (M. fascicularis) לבני אדם במקדש קופים בבאלי, אינדונזיה. Am J Primatol2006;68:934–948. [Crossref], [Google Scholar], 9 Switzer WM, Shaohua T, Ahuka-Mundeke Set al. Novel simian קצף וירוסים מוקצפים ממיני קופים מרובים בנשים מהרפובליקה הדמוקרטית של קונגו. רטרו -וירולוגיה 2012; 9: 100. [Crossref], [Google Scholar] בנוסף, מעט מחקרי האורך של בני אדם נגועים ב- SFV מצביעים על כך ש- SFV אינו מועבר מאדם אחד למשנהו. וירוסים מוקצפים. AIDS Res Hum Retroviruses2007;23:1330–1337. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] ככזה, אפיון הגורמים המשפיעים על העברה זואונוטית של SFV עשוי לספק את המודל העכשווי הטוב ביותר להבנה כיצד ומדוע כמה וירוסי NHP מסוגלים לגרום לאדם מתמשך. - העברה אנושית. הקבוצה שלנו חקרה את הממשק בין בני אדם ל-NHP בבנגלדש במהלך 6 השנים האחרונות, תוך התמקדות בהעברה בין-מינים של חומרים זיהומיים. בבנגלדש, 11–2007. J Virol2013; 87: 558–571. ] J Virol2013;87:572–580. [Crossref], [Google Scholar],13Karlsson EA, Engel GA, Feeroz MMet al. Influenza virus influenza virus in primates non-human. Emerg Infect Dis2012; 18: 1672–1675. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] בנגלדש היא אחת המדינות הצפופות ביותר בעולם, עם אזורים עירוניים רבים הממוקמים בתוך או ליד בתי גידול של NHP. מספר מוניות NHP ילידות בנגלדש, כאשר מקק הרזוס (Macaca mulatta) הוא הנפוץ ביותר והנפוץ. גודל והרכב. שמרן פרימט 2013; 26: 115–124. [גיליון], [Google Scholar] כאשר בית הגידול של היער ממשיך להידלדל, הרזוס הקטן והגמיש מבחינה אקולוגית משגשג בבתי גידול שהשתנו על ידי בני אדם, במיוחד באזורים שבהם גישות תרבותיות מעודדות את סובלנותם. 15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. של מקקי רזוס ונגיף מוקצף הקשור בבנגלדש. Emerg Microbes Infect2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] אף על פי שמגע בין בני אדם לבין מקוקי רזוס מתרחש בעיקר בקהילות שבהן המקקים חופשיים, הוא מתרחש גם במקדשים דתיים שהפכו למקלטים למקקים ובאמצעות בעלות על חיות מחמד. בנוסף, עם נוודים, הידוע בכינויו באד, או קלנדאר, טייל ברחבי האזור במשך מאות שנים, והתפרנס מהעלאת הופעות עם מקקים מאומנים. בניגוד לאפריקה, ציד של קופי בושמה הוא נדיר בבנגלדש, והוא מוגבל לאנשים ילידים באזורי מסכת גבעת צ'יטגונג הגובלים במיאנמר. שבט המרו במסכתות גבעת צ'יטאגונג, בנגלדש. Int J המגוון הביולוגי Sci Manage2007; 3: 56–62. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] ההעברה של SFP לאדם של SFV מתרחשת בדרך כלל באמצעות עקיצות. SFV משכפל באופן פעיל בריריות הפה של קופים נגועים, ומשיג ריכוזים גבוהים ברוק, שבו ניתן לזהות בקלות גנומית ו- mRNA. דיכוי חיסוני המושרה. J Virol2006; 80: 663–670. [Crossref], [Google Scholar] עם זאת, מעט יחסית ידוע על האופן שבו מאפיינים מארחים או ויראליים משפיעים על העברת SFV. אפילו עקיצות קשות אינן גורמות לזיהום באופן אמין .9 סוויצר WM, Shaohua T, Ahuka-Mundeke סט אל. רטרו -וירולוגיה 2012; 9: 100. [Crossref], [Google Scholar] לעומת זאת, כמה בני אדם עם זיהום מתועד אינם זוכרים חשיפה משמעותית לרקמות NHP או NHP. שאלות חשובות אחרות הנוגעות להעברת SFV וזיהום זואנוטי נותרו בלתי פתורות. לדוגמה, בעוד ש-DNA פרויראלי מזוהה באופן מתמשך במשך עשרות שנים בחלק מבני האדם הנגועים ב-SFV; אנשים אחרים מפתחים נוגדנים ל- SFV ללא DNA פרובראלי הניתן לגילוי .Gessain A, Rua R, Betsem E, Turpin J, Mahieux R.HTLV-3/3 ו- retroian virusy foam מוקדם בבני אדם: גילוי, אפידמיולוגיה, העברת מינים בין וירוסים מולקולריים. וירולוגיה 2013; 435: 187–199. [Crossref], [Google Scholar] נותר לגלות אם אנשים מסוימים מנקים זיהום, או שזנים ויראליים מסוימים מסוגלים יותר להתמשך. דרוש מחקר נוסף כדי לקבוע אם, בדומה ל-SIV/HIV, שבו ריקומבינציה בין זנים רטרו-ויראליים במארח חדש היה אירוע מקדים לאבולוציה של נגיפי מגפה, יש עדויות לכך ש-SFVs משתלבים מחדש במארחים אנושיים. מחקרים מעטים נערכו כדי לקבוע אם ריכוז SFV ברוק משפיע או לא משפיע על העברה זואונוטית, או כיצד התגובה החיסונית האנושית מקלה או מונעת זיהום או המשך וירמיה (Soliven et al. ומצאן ואח ', לא פורסם). ובעוד נתונים שנאספו באזורים גיאוגרפיים אחרים והקשרים אחרים של מגע בין בני אדם למקקים סיפקו תובנה כיצד משתנים דמוגרפיים והתנהגות מקאק ואנושית תורמים לסבירות לתוקפנות מקאק-על-אנושית, אך מעט יחסית ידוע על האופן שבו משתנים אלה משפיעים על רטרו-ויראלי. שידור .18 Fuentes A, Gamerl S. השתתפות לא פרופורציונלית לפי שיעורי גיל/מין באינטראקציות אגרסיביות בין מקקים ארוכי זנב (Macaca fascicularis) לבין תיירים אנושיים ביער הקופים Padangtegal, באלי, אינדונזיה. Am J Primatol2005; 66: 197–204. [Crossref], [Google Scholar] כאן אנו מציגים נתונים המתארים חשיפות אנושיות למככי רזוס וזיהום ב- SFV במספר אתרים בבנגלדש ובביצוע קופים. רוב המחקרים האחרים התמקדו באזור של הגן pol (אינטגרז), שנשמר מאוד ולכן עלול שלא לחשוף וריאציה SFV שנמצאת אצל אנשים נגועים ממין. השגנו שיבוטים מרובים מדם מלא ורצפנו חלק מגן ה- SFV, נבחר על פני pol כדי לחשוף וריאציה גנטית SFV גדולה יותר, והשתמשנו בנתוני הרצף להשוואה בין הנגיף שנמצא בבני אדם לזה שנמצא במאקקים איתם הם מתקשרים. . אנו מראים שבני אדם יכולים להידבק במקביל על ידי זני SFV מרובים; חלק מהאנשים נדבקים הן על ידי זן SFV אוטוקתוני (שמקורו נמצא במקום) כמו גם זן הדומה ל- SFV שנמצא במקקים מאזורים גיאוגרפיים אחרים. הגדלת הגיל הייתה גורם סיכון משמעותי להעברה זונוטית של SFV בבני אדם. סקס נשי ודת הינדית עשויים להיות קשורים גם הם לסיכון מוגבר. נתונים אלה בשילוב עם התוצאות הקודמות שלנו 15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Emerg Microbes Infect2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] מצביעים על כך שתנועה של מקקים, זיהומים רבים מסוג SFV ושילוב רטרו-ויראלי, תורמים לאדם, תורמים לגיוון רטרו-ויראלי בבנגלדש. חומרים ושיטות אתרי מחקר ואוכלוסיות אוכלוסיית המחקר כללה 209 נבדקים בני אדם שנדגמו בחמש קהילות אתרים (Sylhet, Bormi, Dhamrai, Narayanganj ו-Charmaguria), כמו גם 13 בעלי קופים מופעים השייכים לקבוצת נוודים המציגים הופעות בהשתתפות המקוקים המאומנים שלהם. האתרים הקהילתיים הוקמו בשנת 2007 במקומות שבהם מקקים נעים בחופשיות ושם התושבים היו מוכנים להשתתף במחקר אורך על העברת חיידקים בין מינים. דגמנו את בעלי הקופים המבצעים באופן אופורטוניסטי, כשנתקלנו בהם בדרך לאתרי לימוד הקהילה שלנו או ממנה. ניתוח של גיוון ה- SFV בקרב קופים מבנגלדש מוצג במחקר המלווה שלנו. 15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Emerg Microbes Infect2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] הנתונים ממחקר זה מהווים גם חלק מנתוני ה- SFV המקאקים שנחקרו במחקר הנוכחי. כאן אנו מציגים תיאור קצר של אתרי השדה (איור 1) הכלולים במחקר זה. וירוס קצף זיאנוטי בזאנגי בבנגלדש משקף דפוסים מגוונים של שידור והדבקה משותפת כל המחברים גרגורי אנגל, כריסטופר ט Small, חאן סוליבן, מוסטפה M Feeroz, שיאוקסינג וואנג, M Kamrul Hasan, Gunwha Oh, SM Rabiul Alam, Karen L Craig, Dana L ג'קסון, פרדריק א מאסן הרביעי, מקסין ליניאל וליסה ג'ונס-אנגל https://doi.org/10.1038/emi.2013.60 פורסם באינטרנט: 25 בינואר 2019 איור 1 דגימות מיקומים ומגוון זני SFV שזוהו בנבדקים אנושיים שנדבקו בזואונוטי. נבדקים אנושיים התראיינו ונדגמו בחמישה אתרים עירוניים ברחבי בנגלדש, שם היו מקקי רזוס חופשיים. לאחרונה הראינו שבכל אחד מהאתרים הללו ניתן לזהות זן ליבה(ים) של SFV במקוקים.15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al.דינמיקה של אוכלוסיית מקוק רזוס ונגיף קצף קשור בבנגלדש. Emerg Microbes Infect2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] זני הליבה של הרזוס SFV מקודדים בצבע במפה זו. עבור נבדקים אנושיים (המסומנים ב- 'BGH') שנמצאו נגועים ב- SFV, השגנו שיבוטים מרובים מדם מלא ורצף חלק מהגן של SFV. נתוני הרצף שימשו להשוואת הנגיף שנמצא בבני אדם לזה שנמצא במקקים מאותו אתר. צבע המעגלים ליד כל אחד ממזהי ה- BGH מסמן את זן ה- SFV שהתגלה בבני אדם אלה. שים לב שארבעה מהנבדקים נדבקו במקביל על ידי זני SFV מרובים וכי חלק מהאנשים נדבקים הן מזן SFV אוטוטוני (שמקורו נמצא) כמו גם מזן דומה ל- SFV שנמצא במקקים מאזורים גיאוגרפיים אחרים. nks, אין מקור ידוע. הצג גודל מלא איור 1 מיקומי דגימה ומגוון זני SFV שזוהו בנבדקים אנושיים שנדבקו בזואונוטי. נבדקים אנושיים התראיינו ונדגמו בחמישה אתרים עירוניים ברחבי בנגלדש, שם היו מקקי רזוס חופשיים. לאחרונה הראינו שבכל אחד מהאתרים הללו ניתן לזהות זן ליבה(ים) של SFV במקוקים.15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al.דינמיקה של אוכלוסיית מקוק רזוס ונגיף קצף קשור בבנגלדש. Emerg Microbes Infect2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] זני הליבה של הרזוס SFV מקודדים בצבע במפה זו. עבור נבדקים אנושיים (המסומנים ב- 'BGH') שנמצאו נגועים ב- SFV, השגנו שיבוטים מרובים מדם מלא ורצף חלק מהגן של SFV. נתוני הרצף שימשו להשוואת הנגיף שנמצא בבני אדם לזה שנמצא במקקים מאותו אתר. צבע המעגלים ליד כל אחד ממזהי ה- BGH מסמן את זן ה- SFV שהתגלה בבני אדם אלה. שים לב שארבעה מהנבדקים נדבקו במקביל על ידי זני SFV מרובים וכי חלק מהאנשים נדבקים הן מזן SFV אוטוטוני (שמקורו נמצא) כמו גם מזן דומה ל- SFV שנמצא במקקים מאזורים גיאוגרפיים אחרים. nks, ללא מקור ידוע. Sylhet ממוקמת בחלק הצפון מזרחי של המדינה, במרחק של 35 ק"מ מהגבול עם מחוז אסאם בהודו, סילת היא העיר השלישית בגודלה בבנגלדש. אוכלוסייה של כ 125 מקקים נמצאת במקדש שאה ג'לאל במרכז העיר. המכושים של סילת נמשכים על פני אתר המקדש ואל השכונה הסמוכה מיד. המקקים של שאה ג'לאל מסופקים באופן קבוע על ידי צוות המקדש ולעתים קרובות מקבלים מזון מהמבקרים במקדש. במחקר השתתפו ארבעה עשר נבדקים בני אדם המתגוררים בקרבת המקדש. בורמי בעיר בורמי, כ -50 ק"מ מצפון לדאקה, יותר מ -200 מקקי רזוס משתרעים ברחבי הכפר, נעים בחופשיות בין אזורים הינדים ומוסלמים, ולעתים קרובות נכנסים לבתים בחיפוש אחר. של אוכל. למרות שחלק מתושבי בורמי מציעים מדי פעם אוכל למקוקים, אין אספקה ​​מסודרת. במחקר השתתפו 105 נבדקים אנושיים מבורמי. Dhamrai העיירה Dhamrai נמצאת 40 ק"מ דרומית מערבית לבורמי. כ 75-100 מקקים נעים בחופשיות דרך דמראי. המקוקים מעדיפים אזורים עם צל גדול ועצי פרי, שנמצאים יותר בשכונות הינדיות. כמו בבורמי, אין אספקה ​​מאורגנת של מקקים. תשעה נבדקים מדמראי נכללו במערך הנתונים הזה. נראיאנגנג 'נראיאנגאנג' היא עיר נמל מאוכלסת בצפיפות כ -20 ק"מ דרומית לדאקה. אוכלוסיית מקוק הרזוס ממשיכה לרדת באזור זה כאשר הפיתוח העירוני עוקף שטחים ירוקים. על פי ההערכות, כ -60 מקאקים בעיר זו אינם מסופקים ואינם מורגלים היטב לבני אדם. 150 נבדקים אנושיים מ-Narayanganj השתתפו במחקר.CharmaguriaCharmaguria ממוקמת XNUMX ק"מ דרומית/דרום-מערבית לדאקה לאורך נהר הפאדמה. יותר מ- 200 מקקים באזור זה מסופקים על ידי ארגון מקומי במיקום מרכזי, ואזורים ירוקים בשפע בעיר הקטנה הזו מספקים מסדרונות טבעיים שלאורכם בעלי החיים נרחבים. במחקר השתתפו 23055 נבדקים אנושיים מצ'רמגוריה. גיוס, הסכמה מדעת ופרוטוקולי דגימה, כולל מעקב אחר אנשים חיוביים ל- SFV, אושרו על ידי מועצת סקירת נושאי האנוש של אוניברסיטת וושינגטון (XNUMX) ולוח סקירה מקביל ב אוניברסיטת ג'הנגירנאגר, בנגלדש. נתונים ביולוגיים ודמוגרפיים של נבדקים אנושיים קודדו במזהים ייחודיים, אנונימיים, שהתחילו ב- 'BanGladesh Human' (BGH). בכל אתר קהילתי יזמו חברי צוות בנגלדש קשר עם מנהיגי השכונות וזיהו מיקום מרכזי בטווח איסוף המקקים לאיסוף נתונים. חברי צוות בנגלדש יצרו אז שיתוף פעולה עם תושבי הקהילה והתגייסו ברגל, וביקשו להשתתף אנשים שהזדהו כמי שננשכו או נפצעו על ידי מקקים. קריטריוני ההכללה לנבדקים כללו גיל גדול מ -18, דיווח עצמי על NHP ו/או מגורים לטווח ארוך (> 20 שנים) בכפר. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל הנבדקים. נתונים דמוגרפיים ונתונים המתארים חשיפות NHP נרכשו באמצעות שאלון שמנהל חבר צוות בשפה המקומית, בנגלית. עשרה מיליליטר של דם מלא נאספו מהוריד האנטקוביטלי של כל נבדק בצינור המכיל חומצה אתראנית אתראנית, שנשמר על קרח לא יותר מ -12 שעות, ואז צנטריפוג. חלקיקי דם מלא ופלזמה נשמרו ב -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. Whatman סטריליות Omni ספוגיות (Whatman, Piscataway, ניו ג'רזי, ארה"ב) שימשו לרכישת דגימות רירית הבוקאלי. ספוגיות הונחו מיד ב 500 µL של Qiagen Buffer RLT (Qiagen, ולנסיה, קליפורניה, ארה"ב) שהתקררו על קרח לא יותר מ -12 שעות לפני שהוקפאו ב -80 ° C עד לניתוח. שיטות אלה זהות במהותן לאלה בהן השתמשנו כדי לרכוש ולאחסן דגימות ביולוגיות הנגזרות ממקקים. 15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Emerg Microbes Infect2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] דגימה חוזרת של בני אדם חיוביים SFV מאושרים אם נושא אנושי אושר חיובי SFV על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), צוות המחקר ניסה ליצור קשר ולדגום את הנושא כשנה לאחר הדגימה הראשונית. . פרוטוקולי איסוף הדגימות הביולוגיות לדגימת מעקב אחר הנבדקים החיוביים ב- SFV היו זהים לשימוש במהלך הדגימה הראשונית. בנוסף, נבדקים חיוביים ל- SFV קיבלו בדיקה גופנית קצרה ונאספה היסטוריה רפואית מעמיקה. דגימת מקוק רזוס כתב יד נלווה לפרויקט זה 15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Emerg Microbes Infect2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] מספק את כל פרוטוקולי הדגימה של בעלי חיים ופרוטוקולים מעבדתיים. רצפי gag של SFV מתוך סך של 184 מקקי רזוס כלולים במחקר הנוכחי (איור 2). אנו כוללים גם במערך הנתונים הזה רצפים שהתקבלו מארבעה רזוס, שניים מדמראי ושניים מבורמי, שהצלחנו לדגום מחדש שנתיים לאחר הדגימה הראשונית שלהם. נגיף קצף סימוני זואוטי בבנגלדש משקף דפוסים מגוונים של שידור והדבקה משותפת כל המחברים גרגורי אנגל, כריסטופר ט Small, חאן סוליבן, מוסטפה M Feeroz, Xiaoxing וואנג, M Kamrul Hasan, Gunwha Oh, SM Rabiul Alam, Karen L Craig, Dana L ג'קסון, פרדריק A Matsen IV, Maxine L Linial וליסה ג'ונס-אנגל https://doi.org/10.1038/emi.2013.60 פורסם באינטרנט: 25 בינואר 2019 איור 2 סיווגי זני דם לקופים מאוכלוסיות דגימה. עבור כל קוף, סרגל צבע המתאים לאוכלוסיית הדגימה של הקופים מוצג ב- (A), ואריחים צבעוניים המתאימים לזנים שנצפו בתוך דגימת הדם של הקוף המוצג ב- (B). הזנים שאינם ליבה מסומנים על פי מערכות יחסים רקומביננטיות שהוקמו עם זנים הורים. התאמות חיוביות מוגדרות על ידי סבירות של לפחות 90% ל -200 זוגות בסיס רציפים או יותר בניתוח cBrother. אזורים בגנום התואמים ללא זנים הורים מעל סף זה לפחות 200 nt סומנו כ- nks (אין מקור ידוע). זוהי גרסה פשוטה יותר של דמות מהנייר המלווה למחקר זה, 15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Emerg Microbes Infect2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] אך עם סיווגי זנים מעודכנים. הצג גודל מלא איור 2 סיווגי זני דם לקופים מאוכלוסיות דגימה. עבור כל קוף, סרגל צבע המתאים לאוכלוסיית הדגימה של הקופים מוצג ב- (A), ואריחים צבעוניים המתאימים לזנים שנצפו בתוך דגימת הדם של הקוף המוצג ב- (B). הזנים שאינם ליבה מסומנים על פי מערכות יחסים רקומביננטיות שהוקמו עם זנים הורים. התאמות חיוביות מוגדרות על ידי סבירות של לפחות 90% ל -200 זוגות בסיס רציפים או יותר בניתוח cBrother. אזורים בגנום התואמים ללא זנים הורים מעל סף זה לפחות 200 nt סומנו כ- nks (אין מקור ידוע). זוהי גרסה פשוטה יותר של דמות מהנייר המלווה למחקר זה, 15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] אבל עם סיווגי זנים מעודכנים. זיהוי SFVWestern blotRhesus macaque fibroblast Telo-RF cell line19Kirchoff V, Wong S, St JS, Pari GS. הצמיחה של rhesus rhadinovirus (RRV). Arch Virol2002; 147: 321–333. [Crossref], [Google Scholar] נדבק ב- SFV M. מולאטה או מ. fascicularis, או לא נשאר נגוע. לאחר 48 שעות, תאים סומנו במאגר מדגם 1 × נתרן dodecyl sulfate (50 מ"מ טריס- HCl (pH 6.8), 10% גליצרול, 2% נתרן dodecyl sulfate, 5% 2-mercaptoethanol, 0.01% ברומופנול כחול) ודגימות elec מועבר באמצעות ג'לים של 10% פוליאקרילאמיד. לאחר העברת חלבונים לממברנות פוליוויניאלידן דיפלואוריד (Millipore Billerica, MA, USA), הממברנות נחסמו במי מלח שנאגרו בפוספט+0.05% Tween-20 המכיל 2% חלב יבש ללא שומן, ושטפו אותו במים והשאירו לייבוש. נעשו רצועות, שכל אחת מהן מכילה שלושה נתיבים (סמן משקל מולקולרי, Telo-RF לא נגוע ותאי Telo-RF נגועים) ונוגדנים ראשוניים (פלזמה אנושית) נוספו בדילול של 1-20 והודגרו במשך לילה ב 4 מעלות צלזיוס. הרצועות נשטפו שלוש פעמים בתמיסת מלח עם חוסם פוספט+0.05% Tween-20 לפני הוספת פרוקסידאז משני נגד צנון פרסת עיזים (Thermo Scientific ו-GE Healthcare Rochester, NY, ארה"ב) בדילול של 1∶5000 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר . הרצועות נשטפו שלוש פעמים נוספות לפני שטיפה במים והנחת מצע מיוצב 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine עבור פרוקסידאז צנון חזרת (Promega Madision, WI, ארה"ב) כדי להמחיש להקות. פלזמה מ-BGH4, אדם ידוע ל-SFV חיובי 20Jones-Engel L, May CC, Engel GAet al.הקשרים מגוונים של העברה זואונוטית של וירוסים מוקצפים באסיה. Emerg Infect Dis2008;14:1200–1208. [Crossref], [Google Scholar] שימש כביקורת חיובית. בידוד ה- DNA מדם מלא הדנ"א הגנומי הכולל הופק מכל הדם של בני אדם באמצעות ערכת מיני הדם QIAamp DNA (Qiagen) על פי פרוטוקול היצרן. חילצנו DNA מ -200 μL של דם מלא. ה-DNA המטוהר חולק ב-200 μL של הגברת AE.PCR של חוצץ של קטעי gag ו-pol מ-DNA גנומי. סך של 15 μL מה-DNA המבודד שימש להגברת PCR של קטעי gag או pol על ידי PCR שני עגול. הסיבוב הראשון של ה- PCR היה תגובה רב-תכליתית עם פריימרים של gag ו- pol (רצף פריימר: G1 (+) (nt 114–134, נלקח מרצף SFB1 GeneBank NC_001364 NC_001736) 5′-AGG ATG GTG GGG ACC AGC TA-3 ′; G2 (-) (nt 1451–1433) 5′-CAG GAA GAG GTA CTC GGG G-3 ′; P1 (+) (nt 5179–5200) 5′-GCC ACC CAA GGA AGT TAT GTG G-3 ′; P2 ( -) (nt 5768–5749) 5′-GCT GCC CCT TGG TCA GAG TG) -3 ′. התגובות הופגרו בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריהן שני מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 38 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, 1 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן 72 מחזורים של 1 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות , 95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ו -30 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. מים שימשו כבקרה שלילית. 2 µL של המוצר PCR שימש כתבנית עבור ה- PCR בסיבוב השני. פריימרים של gag או pol (G3 (+) (nt 190–212) 5'-CAA CCT AGA TGG AGA GCT GAA GG-3'; G4 (−) (nt 1425–1406) 5'-GGG GAC AAA CTA CGG CTG GG-3 ′; P5 (+) (nt 5339–5361) 5′-TAA TCC TCC AGG GTA TCC AAA A-3 ′; P6 (-) (nt 5728–5707) 5′-ATA CCA TCG ACT ACT ACA AGG A-3′) שימשו להגברת קטעים בודדים. התגובות הופתרו בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 52 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ו -1 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. הגדלים הצפויים של מוצרי ה-PCR עבור gag ו-pol הם 1235 bps ו-390 bps, בהתאמה. שיבוט ורצף של שברי gag מוצרי FV PCR טוהרו בג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל QIAquick (Qiagen) לפי פרוטוקול היצרן. השברים המטוהרים נקשרו לתוך וקטור השיבוט של TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) והפכו לתאים מוכשרים של Escherichia coli TOP10 (Invitrogen). מושבות בודדות מרובות עבור כל דגימת גאג נבחרו ו-DNA פלסמיד טוהר ורצף. הרצף בוצע באמצעות פריימרים M13 קדימה ואחורה, כמו גם פריימרים פנימיים קדימה ואחורה לתיקון על ידי מתקן הגנומיקה של אוניברסיטת וושינגטון או GeneWiz Inc. (סיאטל, וושינגטון, ארה"ב). זנים ויראליים מסומנים באמצעות אותיות קטנות כדי להבחין בינם לבין האתרים הגיאוגרפיים שבהם נדגמו בני אדם או מקקים (למשל, Dhamrai הוא אתר מחקר שבו זוהה זן הליבה של dhamrai.) בידוד RNA ממקלחות בוקאליות דגימות ספוגיות בוקאליות במאגר RLT. (Qiagen) הופשרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם 40 U של מעכב RNaseOUT ריבונוקלאז (Invitrogen) ו- 1 U של DNase I ללא Promase (Promega) מיד לפני מיצוי ה- RNA. סך RNA חולץ על פי הפרוטוקול הסטנדרטי באמצעות ערכת מיני RNeasy (Qiagen). RNA טופל שוב ב-40 U של RNaseOUT ו-1 U של DNase I ללא RNase ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן הודגרו דוגמאות ב 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להשבית אנזימים. RNA אוחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש עוקב. תעתוק הפוך- PCR (RT-PCR) של ספוגית רירית RNART-PCR בוצעה כדי לשבט רצפי השתייה חלקית (1235 bp) מ- RNA ספוגית buccal. CDNA מסוג גדיל ראשון סונתז באמצעות מערכת ה- Thermoscript RT-PCR (Invitrogen) על פי פרוטוקול היצרן באמצעות פריימר Oligo (dT) 18. תגובות ה- RT הופעלו ב -85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. CDNAs שהתקבלו שימשו כתבנית לשני PCR עגול כמתואר לעיל להגברת חסימות FV בדם מלא. ניתוח שיטות סידור וניתוח היפר-מוטציה. ניתוח מעמיק של פעילות זו מוצג ב- Matsen et al. (לא פורסם). ניתוח זה הניב יישור רצף שלילי של היפר -מוטציה על ידי הסרת עמודות החשודות בהיפר -מוטציה. יישומים אלה שימשו את שאר הניתוחים במחקר זה, על מנת להימנע מהתערבות של היפר-מוטציה ואות פילוגנטי אמיתי. ניתוחים פילוגנטיים עץ פילוגנטי נבנה מהיישור נטול היפר-מוטציה באמצעות FastTree 2.1.7.21 מחיר MN.DPAAP FastTree מחיר: מחשוב עצי אבולוציה מינימליים גדולים עם פרופילים במקום מטריצת מרחק. Mol Biol Evol2009; 26: 1641–1650. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar], 22 Price MN, Dehal PS, Arkin AP. FastTree 2-עצי סבירות מקסימלית לערכים גדולות. PLoS ONE2010; 5: e9490. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] עץ זה דמיין באמצעות Archaeopteryx (https://sites.google.com/site/cmzmasek/home/software/archaeopteryx). מאותו יישור, SplitsTree 4.12.823 הוסון DH, בראיינט ד יישום של רשתות פילוגנטיות במחקרים אבולוציוניים. Mol Biol Evol2006;23:254–267. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] נעשה שימוש להפקת רשת מפוצלים. ניתוח זנים זוהו על ידי העברת היישור השלילי של היפר-מוטציה דרך אלגוריתם איטרטיבי של קבצי אשכולות. נמצא כי יישום יחיד של UCLUST v1.124Edgar RC. חיפוש וסדרי גודל בסדר גודל גבוה יותר מ- BLAST. ביואינפורמטיקה 2010; 26: 2460–2461. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] הניבו תוצאות אשכולות גרועות בשל אופיו החמדני של האלגוריתם. יושם אלגוריתם חידוש חוזר, שהוצע על ידי מחבר UCLUST בכתובת http://drive5.com/usearch/manual/recenter.html, שטיפל היטב בבעיה זו. עבור כל סיבוב של אשכולות, נוספו רצפי קונצנזוס מהסיבוב הקודם לחלק העליון של מערך לא ממוזג, לפי גודל האשכול מהגדול עד הפחות. לצורך איטרציה זו בוצע אשכולות באמצעות cluster_smallmem, וייצרו רצפי קונצנזוס ואשכולות חדשים. תהליך זה חזר על עצמו פעמיים. הקצאות האשכולות הותאמו עוד יותר על ידי סקריפט שמצא את הצנטרואיד האמיתי של כל אשכול, כהגדרתו ברצף עם מרחק ממוצע מינימלי מנורמל של חמצן לכל רצף אחר באשכול. לאחר מכן התסריט נבדק כדי לוודא שכל רצף מקובץ עם הצנטרואיד שאליו הוא היה הקרוב ביותר (שוב, כפי שהוגדר על ידי מרחק האמינג מנורמל), תוך ביצוע שינויים לפי הצורך. אלגוריתם איטרטיבי זה יושם באמצעות סף של 97.77%. סף זה, למרות שהוא מעט גבוה מזה שנעשה בו שימוש במחקר הנלווה שלנו, 15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. דינמיקה של אוכלוסייה של מקוק רזוס ונגיף קצף קשור בבנגלדש. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] משקף טוב יותר את כמות הגיוון הנמוכה במקצת כתוצאה מהסרת עמודות החשודות בהיפר -מוטציה. כפי שצוין לעיל, זנים ויראליים מסומנים באמצעות אותיות קטנות כדי להבדיל בינם לבין האתרים הגיאוגרפיים שבהם נדגמו בני אדם או מקקים (למשל, Dhamrai הוא אתר מחקר שבו נמצא בעיקר זן הליבה של dhamra.) שיטות סטטיסטיות ניתוח סטטיסטי של משתנים דמוגרפיים היה בוצעה באמצעות חבילת התוכנה הסטטיסטית JMP (SAS Institute, Cary, NC, USA); ניתוח טבלאות מגירה בוצע בעזרת הפונקציה R fisher.test.25 R Core Team. R: שפה וסביבה עבור מחשוב סטטיסטי. וינה: קרן R למחשוב סטטיסטי, 2012. [Google Scholar] תוצאות נתונים דמוגרפיים כולל חשיפות NHP במשך תקופה של 5 שנים, 2007–2011, נאספו דגימות ביולוגיות מ -222 אנשים.

השאר הודעה 

רשימת הודעות